head>
OPTIMALISASI pH PRODUKSI ENZIM SELULASE DARI
BAKTERI ENDOFITIKPseudomonas stutzeri LBKURCC45,
Pseudomonas
cepacia LBKURCC48 DAN
Pseudomonas stutzeri LBKURCC59
Ajaib Prima1, Silvera
Devi 2, Saryono2
1Mahasiswa Program Studi S1 Kimia
2Bidang Biokimia Jurusan Kimia
Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Riau
Kampus Bina
Widya Pekanbaru, 28293, Indonesia
ABSTRACT
The
isolate of LBKURCC45, LBKURCC48 and
LBKURCC59 are endophytic bacteria that have been isolated from the tubers of
dahlia. Endophytic
bacteria can get into the plant tissue through injured plant tissue or because
the bacteria can produce cellulase to degrade plant cell wall that contain
cellulose.
Cellulase is an enzyme that can hydrolyze the β-1-4-glycosidic bond of cellulose. This study was carried out to
determine the optimum pH of cellulase enzyme production (6.0; 6.5; 7.0; 7.5;
and 8.0). Enzyme activity was calculated based on the amount of reducing sugar
formed from Carboxymethyl cellulose (CMC)
substrate hydrolyzed by cellulase enzyme with Nelson-somogyi method. The result
showed that the highest activity of cellulase enzyme obtained at pH 7 at 24
hours production time. The cellulase activity of LBKURCC45, LBKURCC48, and
LBKURCC59 was 0.415 ± 0.043 x 10-3U/mL, 0.353 ± 0.069 x 10-3U/mL,
and 0.246 ± 0.050 x 10-3U/mL, respectively.
Keywords :Carboxymethyl cellulose (CMC), Cellulolytic bacteria, enzyme
activity
ABSTRAK
Isolat
LBKURCC45, LBKURCC48 dan LBKURCC59 merupakan bakteri endofitik yang diisolasi
dari umbi tanaman dahlia. Bakteri endofitik dapat masuk ke dalam jaringan tumbuhan melalui
jaringan tanaman yang luka, atau karena bakteri ini mampu menghasilkan enzim
selulolitik untuk mendegradasi dinding sel tanaman yang mengandung selulosa.Selulase adalah
enzim yang dapat mengkatalisis reaksi pemutusan ikatan β-1-4-glikosidik dalam selulosa.Pada penelitian ini
dilakukanpenentuan pH optimum produksi enzim selulase (6,0; 6,5; 7,0; 7,5; dan
8,0).Aktivitas enzim selulaseyang dihasilkan dihitung berdasarkan jumlah gula
pereduksi yang terbentuk dari proses hidrolisis substrat Carboxymethyl cellulose (CMC) oleh enzim selulase dengan metode Nelson-somogyi.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa aktivitas enzim selulase tertinggi diperoleh
pada pH 7 dengan waktu produksi 24 jam.Aktivitas enzim untuk masing-masing
isolat LBKURCC45, LBKURCC48 dan LBKURCC59 diperoleh sebesar 0,415±0,043 x 10-3U/mL,
0,353±0,069 x 10-3U/mL dan 0,246±0,050 x 10-3U/mL.
Kata Kunci :Carboxymethyl
cellulose (CMC), Bakteri selulolitik, aktivitas enzim
PENDAHULUAN
Enzim
selulase merupakan suatu enzim yang mampu menguraikan selulosa dengan cara
menghidrolisis ikatanβ-1,4 glikosidik
menjadi bentuk yang lebih sederhana yaitu monomer glukosa (Lehninger, 1998).
Selulosa adalah suatu polimer glukosa yang tidak bercabangyang mengandung
unit-unit glukosa yang dihubungkan oleh ikatanβ-1,4-glikosidik. Enzim selulase memiliki aplikasi luas dan sangat
potensial digunakan dalam berbagai industry dan untuk pengolahan limbah
selulosa dalam pembuatan kompos atau untuk penguraian limbah pertanian yang
mengandung selulosa menjadi produk yang bernilai ekonomis yaitu glukosa.
Bakteri endofitik
adalah bakteri
yang hidup dalam jaringan internal tanaman dan tidak bersifat patogen terhadap
inangnya.Bakteri endofitik tidak hanya memiliki kemampuan memproduksi metabolit
sekunder tetapi juga dapat menghasilkan enzim-enzim hidrolitik seperti amilase,
selulase, dan ligninase (Choi dkk., 2005). Bakteri endofitik biasanya masuk
pertamakali melalui bagian atas tanaman seperti batang, bunga, stomata ataupun
kotiledon dan daun yang sobek (Yulianti, 2012), dapat juga masuk karena bakteri
menghasilkan enzimselulase dengan mendegradasi dinding sel tumbuhan yang dominan
mengandung selulosa (Kaga dkk., 2009).
Peneliti sebelumnyatelah melakukan isolasi dari berbagai umbi
dahlia dan diperoleh 19 bakteri endofitik yang belum diketahui kemampuannya
untuk menghasilkan enzim selulase (Robi’a, 2012 & Purba, 2012). Peneliti selanjutnya
telah melakukan uji aktivitas selulase dari19 isolat bakteri endofitik dalam
media selektif yang mengandung Carboxymethyl
cellulose (CMC) sebagai sumber karbon dengan menggunakan metode Nelson-somogyi
dan ternyata diperoleh3 isolat yang menghasilkan enzim selulase dari isolat
lain yaitu KCP2 (LBKURCC45) sebesar 1,66 ± 0,03x 10-3
U/mL, MHP2 (LBKURCC48)
sebesar 0,75 ± 0,04x 10-3 U/mL danKP2 (LBKURCC59) sebesar
7,16 ± 0,06x 10-3 U/mL (Marlinda, 2013).
Produksi enzim dari suatu mikroorganisme
sangat dipengaruhi oleh faktor internal (faktor genetik)dan faktor eksternal
(kondisi fermentasi). Faktor eksternal antara lain faktorsuhu,pH, senyawa
penginduksi, sumberkarbon,
waktu produksi dan agitasi, sedangkan faktor internal atau faktorgenetik sangat
dipengaruhiolehDNA dari spesies mikroorganisme yang menghasilkanenzim selulase
belumtentu menghasilkanaktivitas selulase yang sama. Berdasarkan hal tersebut, dilakukan optimalisasi pH untuk produksi enzimselulase
dari isolat bakteriPseudomonas stutzeri LBKURCC45,
Pseudomonas cepaciaLBKURCC48 dan Pseudomonas stutzeri LBKURCC59.
METODE
PENELITIAN
a. Alat dan Bahan
Alat yang digunakan pada penelitian ini
adalah Autoklaf (All American Model No. 2X),
Spektrofotometer UV-VIS (Thermo
Scientific Model Genesys 10 S), Waterbath
(Grant Instrument Type SUB 28), Vortex(H-VM-300),Shaking Incubator (LabTech
Model LSI-3016R Seri No. B110221102), Oven
(Fisher Scientific Model 655F), Incubator
(Memmert), pH meter (Hanna Instrument H18014), Tabung eppendorf dan
peralatan gelas laboratorium umum lainnya yang digunakan sesuai dengan prosedur
kerja.
Isolat yang digunakan dalam
penelitian ini yaitu LBKURCC45,
LBKURCC48, dan LBKURCC59yangmerupakan koleksi Laboratorium Riset Enzim, Fermentasi dan
Bio molekulerFMIPA UR. Bahan kimia yang digunakan antara lain Carboxymethyl Cellulose(CMC) (Brataco Chemika J1438/4), Nutrient Agar (Merck, No. cat. 1.05450.0500),Nutrient Broth (NB) (Merck, No. cat. 1.05443.0500), glukosa,
larutan buffer fosfat, reagen Nelson-somogyi, reagen Arsenomolibdat, dan
bahan-bahan lain yang digunakan adalahbahan tingkat analisis sesuai dengan
metoda kerja.
b. Peremajaan bakteri
Peremajaan isolat bakteri LBKURCC45,
LBKURCC48 dan LBKURCC59 dilakukan dengan mengambil satu ose stok isolat secara
aseptis dari stok NB, kemudian diinokulasikan kembali pada Nutrient Agar (NA) miring yang steril,selanjutnya diinkubasi pada suhu 370C selama
24 jam.
c. Pembuatan inokulum bakteri selulolitik
Bakteri dari
hasil peremajaan satu tabung agar miring diambil secara aseptis dengan
mengambil satu ose stok isolat dan dimasukkan ke dalam 50 ml media Nutrient Broth (NB), kemudian diinkubasi
di dalam shaker inkubator dengan kecepatan agitasi 120 rpm pada suhu 370C
selama 12 jam untuk digunakan sebagai inokulumdan selanjutnya dilakukan pengukuran Optical
density (OD) pada panjang gelombang 660 nm.
d. Pembuatan media cair untuk produksi enzim selulase
Bahan
yang digunakan untuk produksi enzim selulase dari isolat bakteri selulolitik sesuai dengan media
Philippidis (1991), yang terdiri dari KH2PO40,2 g; MgSO4.7H2O
0,03 g; (NH4)2SO4 0,14 g; CaCl2.2H2O
0,03 g; CoCl2.6H2O 0,0001 g; Co(NH2)2
0,03 g; FeSO4.7H2O 0,00092 g; MnSO4.H2O
0,0003 g; ZnSO4.7H2O
0,00027 g; CMC 1 g. Semua bahan dilarutkan dalam 100 mL buffer fosfat
dengan variasi pH 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; dan 8,0. Media ini dimasukkan ke dalam
Erlenmeyer 250 mL, kemudian disterilisasi dengan autoklaf pada tekanan 15 lb,
1210C selama 20 menit.Media siap diinokulasi jika tidak ada tanda-tandakontaminasisetelah diinkubasi selama 24 jam pada
suhu kamar.
e. Optimalisasi pH produksi enzim selulase
Inokulum
isolat LBKURCC45,
LBKURCC48 dan LBKURCC59sebanyak 10% ditambahkan masing-masing
ke dalam media cair produksi enzim 100 ml, kemudian diinkubasidalam shaker incubator dengan kecepatan
agitasi 120 rpm pada suhu 370C selama 24 jam. dengan
variasi pH media (6,0; 6,5; 7,0; 7,5 dan 8,0).Ekstrak kasar enzim
selulase yang terdapat dalam media dipisahkan dari sel isolat dengan cara disentrifugasi
dingin selama 10 menit dengan kecepatan 9500 rpm. Sebelum sentrifugasi, media
kultur yang berisi enzim didinginkan dalam lemari pendingin pada suhu 40C
selama kurang lebih 1 jam. Supernatan disaring dan ditambahkan NaN3sebanyak
0,02% (b/v) ke
dalam setiap larutan supernatan jika tidak langsung dilakukan uji aktivitas
enzim.
f.
Penentuan
aktivitas enzim selulase
Aktivitas
ekstrak kasar enzim yang dihasilkan ditentukan dengan metode Nelson-Somogyi.
Tabung uji diisi 0,5 mLsubstrat CMC 2% yang dilarutkan dengan buffer fosfat
0,05 M pH 6,0, sedangkantabung kontrol dibiarkan dalam keadaan kosong, kemudian dimasukkan ke dalam
waterbath selama 5 menit pada suhu 400C. Tabung uji dan kontrol
ditambahkan 0,5 mL enzim dengan tanpa mengeluarkan tabung-tabung dari waterbath
dan diinkubasi selama 30 menit. Tabung blanko diisi larutan buffer fosfat 0,05
M pH 6,0 sebanyak 1 mL. Masing-masing tabung ditambahkan 0,5 mL reagenNelson-somogyi
dan tabung kontrol ditambahkan 0,5 mL substrat CMC 2%, Semua tabung reaksi
tersebut dipanaskan dalam penangas air selama 20 menit dan didiamkan hingga
suhu kamar. Selanjutnya, reagen arsenomolibdat ditambahkan 0,5 mL, divorteks
dan didiamkan selama 5 menit. Tabung-tabung reaksi tersebut ditambahkan 3 mL
akua demineralisata, kemudian didiamkan selama 30 menit.Jika terdapat endapan,
larutan disentrifugasi selama 10 menit pada kecepatan 9500 rpm dan absorbansi
filtrat diukur.Pengukuran aktivitas enzim masing-masing dilakukan tiga kali
pengulangan untuk setiap sampel.Sebagai standar dibuat larutan standar dengan
berbagai konsentrasi.Absorbansi masing-masing larutan diukur menggunakan
spektrofotometer UV-VIS pada panjang gelombang 540 nm. Hal yang sama juga
dilakukan pada sampel dengan variasi pH 6,5; 7,0; 7,5 dan 8,0.
HASIL
DAN PEMBAHASAN
a. Penentuan pH optimal untuk produksi enzim selulase
Aktivitas ekstrak kasar enzim yang dihasilkan
dari ketiga isolat ini ditentukan berdasarkan jumlah gula pereduksi yang
dihasilkan
dari reaksi selulase menggunakan substrat CMC 2%tiap satuan waktu. Kadar
gulapereduksi ditentukan dengan metode Nelson-somogyi dan aktivitas selulase
dari ketiga isolat pada setiap
variasi pH dapat dilihat padaTabel 1.
Tabel 1: Aktivitas
ekstrak kasar enzim selulase yang dihasilkan dari bakteri LBKURCC45, LBKURCC48 dan LBKURCC59 pada variasi pH media produksi
Variasi pH media
|
Aktivitas
Enzim Selulasex 10-3 (U/mL) *
|
||
LBKURCC45
|
LBKURCC48
|
LBKURCC59
|
|
6,0
|
0,080 ± 0,032c
|
0,083 ± 0,033c
|
0,080 ± 0,028b
|
6,5
|
0,210 ± 0,065b
|
0,228 ± 0,057b
|
0,112 ± 0,019b
|
7,0
|
0,415 ± 0,043a
|
0,353 ± 0,069a
|
0,246 ± 0,050a
|
7,5
|
0,133 ± 0,078bc
|
0,155 ± 0,028bc
|
0,143 ± 0,081ab
|
8,0
|
0,128 ± 0,029bc
|
0,081 ± 0,063c
|
0,156 ± 0,086ab
|
Hasil
Anova dan uji Duncan jarak berganda pada taraf 5% menunjukkan bahwa aktivitas
selulase tertinggi dari bakteri LBKURCC45, LBKURCC48 dan LBKURCC59 diperoleh
pada pH produksi 7. Uji statistik untuk aktivitas enzim selulase LBKURCC45 dan
LBKURCC48 menunjukkan berbeda nyata secara signifikan (p˂0,05) antara pH 7
dengan pH 6,0; 6,5; 7,5 dan 8,0, sedangkan untuk LBKURCC59 ternyata tidak
menunjukkan perbedaan yang signifikan (p˃0,05) pada pH 6,0; 6,5; 7,5 dan 8,0. Grafik
optimalisasi pH dapat dilihat pada Gambar 1.Secara umum grafik menunjukkan
aktivitas enzim selulase meningkat dari pH 6 sampai pH optimum 7, kemudian aktivitas
enzim selulase menurun jika pH semakin tinggi.Penurunan yang terjadi diatas pH optimum diduga selama proses
inkubasi telah terjadi perubahan kondisi lingkungan enzim dari pH normal
menjadi pH yang basa (Megahati, 2001).Perubahan pH yang tidak sesuaiakan
menyebabkan daerah katalitik dan konformasi enzim ikut berubah. Hal ini terjadi
karena adanya perubahan sifat ionikyang
terdapat pada gugus karboksil dan gugus amino dari enzim. Perubahan pH tersebut
dapat menyebabkan terganggunya pengikatan enzim dengan substrat, sehingga
perubahan pH ini nantinya akanmengakibatkan denaturasi enzim dan menurunnya
aktivitas enzim.
Gambar 1. Hubungan pH produksi dengan aktivitas
enzim selulase
KESIMPULAN
Hasil optimalisasi pH dari ketiga
bakteri selulolitik yaitu LBKURCC45, LBKURCC48 dan LBKURCC59 menunjukkan bahwa
pH terbaik diperoleh pada pH 7 dengan masing-masing aktivitas enzim selulase
sebesar 0,415 ± 0,043 x 10-3U/mL; 0,353 ± 0,069 x 10-3U/mL
dan 0,246 ± 0,05 x 10-3U/mL.
UCAPAN
TERIMA KASIH
Penulis
mengucapakan terima kasih kepada Ibu Dra. Silvera devi Sy, MSi dan Bapak Prof.
Dr. Saryono, MSi yang telah membimbing dan memotivasi serta membantu penelitian
dan penulisan karya ilmiah ini.
DAFTAR
PUSTAKA
Choi, Y.W.,
Hodgkiss, I. J., & Hyde, K. D. 2005. Enzyme Production by Endophytes of Brucea Javanica.Journal Agricultural Technologi.1:55-65.
Kaga,
H., Mano, H., Tanaka, F., Watanabe, A., Kaneko, S., &Morisako, H. 2009.Rice Seeds as Source of Endophytic Bacteria.Microbes Environ. 24(2): 154–162.
Lehninger, A. L. 1998.Dasar-Dasar
Biokimia. Jilid 1. Penerbit Erlangga, Jakarta.
Marlinda, S.
2013. Uji Aktivitas Spefisik Enzim Selulolitik dari Beberapa Bakteri Endofitik
Umbi Tanaman Dahlia (Dahlia
variabilis).Skripsi FMIPA UR. Pekanbaru.
Megahati, R., R., P. 2001. Deteksi Mutasi Gen Penisilin Penisilin
G Asilase Dari Escherichia coli B130 Hasil PCR Mutagenik dengan Metode
Single Strand Comformation Polymorphism (SSCP).Tesis Biologi Institut Teknologi Bandung. Bandung.
Philippidis,
G. P. 1991. Evaluation of The
Current Status of The
Cellulase Production Technology. Biochemical Engineering and Modeling for
Cellulase Production. B01778: 9.
Purba, T. M., Saryono.,&Puspita,
F. 2012. Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Endofitik dari Umbi Tanaman Dahlia (Dahlia variabilis).Jurnal Ilmiah Sains Terapan.3(2): 91-95.
Robi’a., Saryono.,&Pusfita, F. 2012. Skrining Bakteri Endofitik dari Umbi Tanaman
Dahlia (Dahlia variabilis).Jurnal Ilmiah Sains Terapan.3(2):
153-158.
Saropah, A.,
Jannah, A., & Maunatin, A. 2012.Kinetika reaksi enzimatik ekstrak kasar
enzim bakteri selulolitik hasil isolasi dari bekatul.Alchemy.2(1):34-45.
Yulianti,
T. 2012. Menggali Potensi Endofit untuk Meningkatkan Kesehatan Tanaman Tebu
Mendukung Peningkatan Produksi Gula.Perspektif.11(2):